河南省科技攻关计划项目 申 请 书 姓 名： JiangDongbao 项目名称： FGFR4 表达对结直肠癌细胞株生物学行 为的影响及作用机制的研究 单 位： 郑州大学 联系电话： 填报说明 请根据自己的专业及研究方向，针对某具体临床问题，结合所学习临床科研方法的 一种或几种写出一份科研设计。完成后，文件以个人姓名命名，发至： 1736601711@qq.com。考核成绩依设计书优略评定。截至日期 2013 年 11 月 8 日。 一、项目的立项依据和意义（说明国内外相关领域技术发展水平和趋势等） 结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是起源于结直肠黏膜上皮的恶性肿瘤，是临床最常 见的恶性肿瘤之一。我国每年结直肠癌新发病例超过 25 万，死亡病例约 14 万，新发与死 亡病例均占全世界同期结直肠癌病例的 20%[1]。局部进展期结直肠癌 5 年癌症相关生存率 为 70%，而发生远处转移的晚期结直肠癌 5 年生存率仅为 12%，且生活质量低。目前结直 肠癌新辅助化疗、辅助化疗、姑息化疗方案很多，如 ECF、DCF、奥沙利铂+氟尿嘧啶、 顺铂+氟尿嘧啶等，但其最核心的药物是氟尿嘧啶，在此基础上联合其他化疗药物。近年 来，靶向药物在结直肠癌治疗领域的研究和应用成为一大热点，作用于 EGFR 的爱必妥、 作用于 VEGF 的贝伐单抗、针对 Her-2 的赫赛汀等已进入胃癌治疗的临床实验中。 成纤维生长因子受体（FGFRs）是一个多基因家族,属免疫球蛋白基因超家族成员,是 分布在多种细胞上的膜蛋白，FGFR 家族成员有 FGFR1、FGFR2、FGFR3 以及 FGFR4。 它们的特点是在胞膜外含有 3 个免疫球蛋白样结构域，一个疏水的跨膜结构，胞浆内含有 两个呈串联结构的酪氨酸激酶功能区。FGFR1～3 在体内是广泛分布的,而 FGFR4 主要在 发育早期大量表达,而且主要分布在视网膜和肾脏。编码 FGFR4 蛋白的 FGFR4 基因位于 5 号染色体，5q35.1-qter，基因编号为 2264。FGFR4 蛋白是一类具有自身磷酸化活性的跨膜 酪氨酸激酶受体中的一种,在胚胎发育、组织修复和血管形成等进程中起着十分重要的作 用[2,3]。但 FGFR4 在恶性肿瘤中的研究相对较少，Pubmed 检索该分子在胃癌中的研究仅见 几篇报道，而且研究尚不深入。但有学者认为，FGFR 家族是在恶性肿瘤诊治方面是一个 新兴的领域，有广阔的应用前景[4]。 FGFR4在常见的恶性肿瘤如乳腺癌、胰腺癌、横纹肌肉瘤及肾细胞癌中均呈高表达 [57] 。Meijer D等报道FGFR4表达是复发性乳腺癌患者的独立的预后因素[8]；Milano等研究亦 认为FGFR4可以预测三苯氧胺治疗乳腺癌的疗效[9]。Gowardhan等[10] 研究报道，与良性增 生相比，FGFR4在前列腺癌中的表达显著上调；FGFR4的表达与Gleason评分相关；生存 分析显示，FGFR4过表达与较差的预后相关，无病生存期缩短。Ho HK等对57对肝细胞肝 癌组织及对应的正常组织进行real time PCR定量检测FGFR4在mRNA水平的表达，统计结 果显示，FGFR4的表达与患者的主要临床病理资料无相关性，可能是由于样本量较小 [11] 。Streit等[12]通过免疫组化技术对137例恶性黑色素瘤组织标本进行FGFR4蛋白水平表达 进行检测，结果显示，FGFR4在恶性黑色素瘤组织标本中的表达率为45%，FGFR4的表达 与肿瘤临床分期、微溃疡形成、原发灶的数目、总生存期及无病生存期均有明显相关性， 作者认为FGFR4蛋白的表达可作为恶性黑色素瘤进展的潜在指标。 自 2002 年，Bange 等[13] 发现了 FGFR4 Gly388Arg 这一胚系多态性后，该 SNP 现已成为 了一个研究的热点。该 SNP 是位于 FGFR4 第 9 外显子 388 密码子上，碱基 G 转变为 A， 导致了 FGFR4 的氨基酸序列发生了变化，即 388 位氨基酸由甘氨酸转变为精氨酸，该位 点位于 FGFR4 的高度保守序列中。 1 据报道，FGFR4 Arg388 基因型并不影响肿瘤的发生过程，因为在乳腺癌患者及正常对 照中，该 SNP 在两组中的分布比例大致相同，FGFR4 Arg388 基因型均占 50%左右。但在 淋巴结阳性的乳腺癌患者中，FGFR4 Arg388 基因型与更短的无病生存期和总生存期有关 [14] 。有报道显示，携带有 Arg388 等位基因的肺癌患者肿瘤发病年龄更早，差的临床分期 的比例更高，生存期更短，所以 FGFR4 Gly388Arg 可能预测肺癌的预后 [15] 。这些发现强 调了该 SNP 位点具有临床意义，这一推断已在头颈部癌、前列腺癌、肺癌等恶性肿瘤中 得以证实[3, 16-18]。当然也有一些文献认为该 SNP 无预后价值。近来，一项随机的 II 期实验 研究中，257 例 T2-4/N0-2/M0 原发性乳腺癌患者接受了阿霉素和环磷酰胺（AC）或阿霉 素和培美曲唑（AP），序贯多西他赛（Doc）作为新辅助化疗，多因素分析显示，FGFR4 Arg388 是 AC-Doc 作为 乳腺 癌患者 新辅助治疗方案病 理性完全 缓解 的独立预 后因 素 [19] 。Sugiyama 等发现了 MT1-MMP/FGFR4 这个复合物，其中 FGFR4 R388 等位基因可通 过减少溶酶体对 MT1-MMP 的降解而增加对胶原蛋白的侵袭；通过 siRNA 下调 MT1-MMP 或 FGFR4-R388 均可阻止细胞侵袭和生长[20]。近来一项 meta 分析显示，FGFR4 Gly388Arg 多态性与前列腺癌的进展相关，可作为前列腺癌的进展的一个分子标记[21]。 在目前发现的 20 余种成纤维生长因子（ FGF）中，能与 FGFR4 结合的生长因子有 FGF1, 2, 4, 6, 8, 9, 16, 17, 18 和 19。其中只有 FGF19 仅对 FGFR4 特异性结合[22]。且无论有 无 β-Klotho 存在，FGF19 均可与 FGFR4 结合而引起后续的生物学效应 [23]。FGFR4 的激活 是 FGF19 促进肝细胞增殖，诱导肝癌形成的机制[24] FGFR4 在在结直肠癌中的研究甚少，故而本课题重点探讨了 FGFR4 的表达对结直肠癌 细胞株的生物学行为的影响及作用机制。本研究为了解 FGFR4 对结直肠癌细胞株生物学 特性的影响，进行了体外功能实验，通过慢病毒转染技术下调 FGFR4 的表达，然后进行 了一系列功能实验，包括增殖实验、克隆实验、侵袭实验、划痕实验、流式细胞仪检测细 胞的凋亡和细胞周期的变化，western blot 检测凋亡及细胞周期相关蛋白在干扰前后的变 化，初步探讨 FGFR4 影响结直肠癌细胞株生物学行为的机制。 2 1.International Agency for Research On Cancer. World Health Organization. GLOBOCAN 2012: Estimated Cancer Incidence,Mortality and Prevalence Worldwide in 2012[EB/OL] [201412-5]. 2. Eswarakumar VP, Lax I, Schlessinger J. Cellular signaling by fibroblast growth factor receptors. Cytokine Growth Factor Rev 2005; 16:139–49. 3. Wang J, Stockton DW, Ittmann M. The fibroblast growth factor receptor-4 Arg388 allele is associated with prostate cancer initiation and progression. Clin Cancer Res 2004;10:6169–78. 4. Katoh M. Genetic alterations of FGF receptors: an emerging field in clinical cancer diagnostics and therapeutics. Expert Rev Anticancer Ther 2010;10:1375-9. 5. Jacquemier J, Adelaide J, Parc P, et al.Expression of the FGFR1 gene in human breastcarcinoma cells. Int J Cancer 1994;59:373-8 6. Leung HY, Gullick WJ, Lemoine NR. Expression and functional activity of fibroblast growth factors and their receptors in human pancreatic cancer. Int J Cancer 1994;59:667-75. 7. Takahashi A, Sasaki H, Kim SJ, et al. Identification of receptor genes in renal cell carcinoma associated with angiogenesis by differential hybridization technique. Biochem Biophys Res Commun 1999;257:855-9. 8. Meijer D, Sieuwerts AM, Look MP, et al. Fibroblast growth factor receptor 4 predicts failure on tamoxifen therapy in patients with recurrent breast cancer. Endocr Relat Cancer. 2008;15:101-11. 9. Milano A, Dal Lago L, Sotiriou C, et al. What clinicians need to know about antioestrogen resistance in breast cancer therapy. European Journal of Cancer 2006 ;42:2692–705. 10. Gowardhan B, Douglas DA, Mathers